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ago 13 2015

Diferencias entre asmáticos y no asmáticos en el perfil de reconocimiento de la IgE a distintos alergenos de ácaros

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Resch Y,  Michel S,  Kabesch M, Lupinek C, Valenta R, Vrtala S. Different IgE recognition of mite allergen components in asthmatic and non-asthmatic patients. J Allergy Clin Immunol 2015.

(Acceso libre)

Microarreglo allergen chip Las novedosas herramientas de diagnóstico molecular abren nuevas posibilidades para estudiar la relación entre sensibilización a diferentes componentes alergénicos de los ácaros de  polvo doméstico y el desarrollo del asma. Es ya conocido que diversas funciones biológicas de los alergenos de ácaros guardan estrecha relación con su capacidad sensibilizante y proinflamatoria en las vías aéreas. El presente estudio de un grupo de investigadores de la Universidad Médica de Viena en Austria, constituye un aporte relevante en ese sentido. En el mismo los autores evalúan la respuesta de anticuerpos IgE e IgG hacia un panel de 7 alergenos del ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 10 y Der p 21 y Der p 23) en niños atópicos con asma o sin ella en comparación con un grupo control de niños no atópicos. Se trata de un estudio transversal que emplea la poderosa tecnología de los microarreglos ISAC, también llamados biochips que permite la detección múltiple de IgE hacia diferentes moléculas.

En el estudio los alergenos reconocidos con mayor frecuencia fueron Der p 1, Der p 2 (ambos considerados ampliamente los más importantes) y Der p 23. Este último alergeno, una proteína de 14 Kda, proveniente de la matriz peritrófica intestinal (membrana compuesta de proteínas y quitina) del ácaro, fue  caracterizado en el 2013 por este mismo grupo científico y parece ser tan relevante como Der p 1 y Der p 2. La combinación de Der p 1, Der p 2 y Der p 23 resultó positiva en el 92.4% de los pacientes. Como era esperado, los pacientes asmáticos, como promedio, reconocieron un mayor número de  alergenos y con mayor frecuencia que los atópicos no asmáticos: 70% de los pacientes asmáticos reaccionaron a entre 3 y 6 alergenos, mientras que 74% de los no asmáticos reconocían solo entre 1 y 3. Los niveles de IgE hacia ciertos alergenos (Der p 1, Der p 2, Der p 5 y Der p 23) resultaron también mayores en el grupo de niños asmáticos. Diferencias significativas entre asmáticos y no asmáticos fueron observadas para los alergenos Der p 2, Der p 5 y Der p 7, lo cual sugiere que la sensibilización a los mismos juega un papel importante en la evolución de la enfermedad alérgica respiratoria hacia el asma. De hecho, los tres alergenos son proteínas de unión de ligandos lipídicos y al menos en dos de ellos (Der p 2 y Der p 7) esa función biológica estaría vinculada a la inducción de inflamación en mucosas respiratorias ante la exposición a LPS, según estudios anteriores.

Por otra parte, los anticuerpos IgG tendrían un efecto protector o bloqueador antialérgico. No es aún suficiente el conocimiento existente sobre el grado en que coinciden los espectros de reconocimiento epitópico de la IgE y la IgG, aspecto que pudiera estar relacionado con la existencia de diferentes vías de maduración y cambio de clase hacia IgE. En ese sentido el presente estudio arroja también resultados polémicos. Entre los asmáticos, el número de pacientes con IgG específica hacia los alergenos evaluados fue menor con relación a los atópicos no asmáticos, aunque los niveles fueron comparables entre ambos grupos, lo cual concuerda solo parcialmente con el efecto protector de la IgG. En contraste, los niveles de IgG fueron menores para los no atópicos. Aún más, los alergenos con frecuencias de reconocimiento más altas por la IgG no coinciden precisamente con el perfil de la IgE. Ellos fueron Der p 2, Der p 10 y Der p 23 en los asmáticos; Der p 5 y Der p 10 en los atópicos no asmáticos; Der p 1, Der p 7 y Der p 21 en los no atópicos.  En tanto que las diferencias en cuanto a niveles cuantitativos entre los grupos asmático o no asmático fueron significativas solo para Der p 1 y Der p 10 (Der p 10 es la tropomiosina del ácaro, un conocido panalergeno con reactividad cruzada incluso con alergenos alimentarios como el camarón).

Asimismo, las respuestas IgE e IgG alergeno específicas muestran correlación cuantitativa solo de modo parcial con valores peores en el grupo de los asmáticos. Los autores identifican tres poblaciones diferentes: pacientes solamente con IgG alergeno específica, con IgG e IgE y, por último, solo con IgE. Las proporciones de las tres poblaciones varían en dependencia del alergeno. Así, para Der p 1 se identificó un grupo considerable de niños asmáticos que mostraron IgE en ausencia de IgG, aunque tanto para Der p 1, como para Der p 2 y Der p 23 hubo predominio claro de los individuos con IgG+IgE en el grupo de los asmáticos, mientras que para el resto de los alergenos una parte considerable mostró solamente o predominantemente IgG. En general, el tránsito de atópicos no asmáticos a asmáticos (o sea, el desarrollo de al asma en los individuos alérgicos) pareciera estar relacionado con el desplazamiento de la respuesta desde IgG hacia una repuesta mixta de IgG+IgE. Sin embargo, la presencia de individuos asmáticos con respuesta de IgE en ausencia de IgG (más marcada para Der p 1) entra en contradicción con el modelo secuencial de cambio de clase donde la IgG4 debe preceder a la IgE, lo cual sugiere alguna característica particular de este alergeno (¿función proteasa?) que favorecería una vía diferente y directa de cambo de clase hacia IgE.

Ambos efectos observados en los pacientes asmáticos: un espectro de reconocimiento mas amplio y  mayores niveles de IgE, implican una carga más densa y mas variada de los mastocitos, basófilos, y células presentadoras de antígenos, con IgE específica unida a sus receptores y, por lo tanto, hace más sensibles a los pacientes ante la exposición a fuentes alergénicas, lo cual constituye indudablemente un signo de agravamiento de la enfermedad alérgica.

De modo general, los autores concluyen que los perfiles  IgE e IgG hacia diferentes alergenos de ácaros difieren considerablemente entre los niños atópicos con o sin síntomas de asma. Los niños asmáticos se caracterizan, entonces, por un repertorio IgE más expandido  y niveles incrementados de IgE específica. Desde el punto de vista clínico estos resultados pudieran ser útiles para el diseño de pruebas de diagnóstico específicas para el fenotipo alérgico del asma. Indudablemente, el trabajo aporta para una mejor comprensión del papel de los alergenos de ácaros en la inducción del asma alérgica, aunque se requieran más estudios que profundicen en la complejidad del repertorio de anticuerpos y su posible asociación con diferentes fenotipos asmáticos.

Por: DrC Alexis Labrada

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abr 15 2015

El genoma, transcriptoma y microbioma de Dermatophagoides farinae

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The draft genome, transcriptome, and microbiome of Dermatophagoides farinae reveal a broad spectrum of dust mite allergens. Chan TF et al. J Allergy Clin Immunol 2015 Feb;135(2):539-48. (texto completo libre)

d-farinaeMientras que el término “genoma” ya es de dominio popular, el de “transcriptoma” está menos difundido. Se refiere  al conjunto de “transcripciones” del ADN genómico a ARN mensajero; o sea, equivale al número de proteínas en vías de síntesis (“expresadas”, dicho en lenguaje de la biología molecular) en un organismo o tejido en el momento estudiado. Por su parte “microbioma” denomina  al conjunto de genomas microbianos co-habitantes del organismo hospedero, habitualmente como microbiota normal del tracto digestivo.

El presente artículo constituye un hito importante en la alergología experimental al publicar por primera vez una versión preliminar del genoma (acompañado de transcriptoma  y microbioma) de una de las principales fuentes alergénicas mundiales: el ácaro del polvo doméstico Dermatophagoides farinae. La publicación del genoma permite tener una visión abarcadora de la totalidad de las proteínas potencialmente alergénicas provenientes de este arácnido y evaluar así sus similitudes y diferencias con otras especies. También predecir la existencia de posibles proteínas alergénicas no identificadas anteriormente, por homología con alergenos conocidos. En total, los autores identificaron 16 376 genes y 9 142 transcripciones a ARNm, correspondientes a igual número de unidades polipeptídicas.

El estudio confirmó la presencia de 20 genes (con sus respectivas transcripciones) de alergenos conocidos anteriormente: desde Der f 1 hasta Der f 23, excepto Der f 17 (que aunque ha sido reportado en bases de datos, no se conoce su secuencia de ADN, de modo que su existencia o identidad parece dudosa), así como, los grupos 12 y 19 que hasta ahora parecen exclusivos de Blomia tropicalis. Otros 7 alergenos llamados “no canónicos” se corresponden a secuencias “ortólogas” que en otras especies bastante alejadas taxonómicamente han demostrado generar proteínas alergénicas, tales como profilina (un conocido pan-alergeno hasta ahora encontrado en plantas), Alt a 6 (del hongo Alternaria alternata), Mala s 6 (del hongo Malasezzia simpodialis causante de eccema atópico, dermatitis ganulomatosa y pitiriasis versicolor en humanos) y otros.

Otro de los aportes importantes del trabajo se refiere a la identificación de un nuevo alergeno mayor: denominado Der f 24. Es una proteína de unión a Ubiquinol-Citocromo-C reductasa, la cual juega un papel crítico en la generación de adenosín trifosfato (ATP) e interviene en la llamada respiración celular que consiste en el conjunto de reacciones bioquímicas por las cuales determinados compuestos orgánicos son degradados completamente proporcionando energía aprovechable por la célula, principalmente en forma de ATP. Estructuralmente, es una lipoproteína multimérica transmembrana de 14.45 kDa. Además de su identificación genómica, la proteína recombinante pudo ser expresada en E. Coli y mostró reactividad in-vitro con la IgE sérica de 22 pacientes alérgicos y pruebas cutáneas positivas en 5 de 10 pacientes positivos al extracto de D. farinae.

Al ácaro del polvo doméstico se le ha llamado en ocasiones “ácaro ciego” por la falta aparente de órganos oculares. No obstante, se conoce desde 1975, por evidencias experimentales (Furumizo y Warton[1]) que estos ácaros son capaces de sensar la luz en el rango de longitudes de onda entre 500 y 575 nm (luz verde) y probablemente entre 600 y 675 nm (rojo-naranja); sin haberse podido precisar, sin embargo, la localización anatómica de sus fotorreceptores. El presente estudio arroja más luz sobre los ácaros “ciegos” al detectarse la presencia en los mismos de los genes de la llamada vía de  fototransducción, similar a otros invertebrados, e incluso la expresión de una proteína similar a la Rodopsina, lo cual provee una evidencia molecular importante del proceso de fotodetección en el rango de 500 a 575 nm.

Quizá el aporte más trascendente del trabajo se refiere a la caracterización completa del microbioma del ácaro, identificando un amplio espectro de microorganismos que incluyó más de 100 especies diferentes. El género predominante ampliamente fue Enterobacter con 63.4% del total. El hallazgo contrasta con un estudio anterior que había vislumbrado la presencia de ADN del género intracelular Bartonella.[2] En este estudio las mismas solo representaron 1.7 %. Las enterobacterias son contaminantes frecuentes del ambiente y son reportadas en cerca del 10 % de las infecciones nosocomiales del tracto respiratorio, en particular, la especie E. cloacae, que aquí resultó también predominante. En el trabajo se logra identificar la distribución de este microorganismo a todo lo largo del tracto digestivo del ácaro, con la ayuda de un anticuerpo monoclonal marcado. Entonces, los ácaros pueden servir como un hospedero intermediario para las enterobacterias y contribuir a su transmisión por vía respiratoria, ya que las partículas fecales, por su tamaño y características físicas son inhalables. De ese modo, se provee una posible conexión adicional entre las infecciones del tracto respiratorio y la aparición y desarrollo de la enfermedad alérgica, eventos, cuya asociación es muy conocida de la experiencia clínica y la evidencia epidemiológica.

La localización de estos microorganismos enel tracto digestivo y su capacidad de síntesis de aminoácidos y tiamina sugieren la existencia de relaciones endosimbióticas entre el ácaro y su microbioma, como es bastante común en el reino animal. Una evidencia en ese sentido es el hecho experimental relatado en el trabajo de que los ácaros no son capaces de sobrevivir ante la adición de ampicilina al medio de cultivo, antibiótico capaz de eliminar o reducir drásticamente su microbiota. En esa misma dirección, se identificó en el genoma del ácaro una enzima bacteriolítica digestiva.

Dentro del microbioma, de 20 a 30 genes codifican enzimas involucradas en la biosíntesis de LPS, componente de las membranas de bacterias Gran-negativas. Este hallazgo concuerda con la presencia conocida de endotoxinas en los extractos alergénicos de ácaros, actualmente presentes en el mercado, y empleados para la inmunoterapia alergeno específica. Hasta el momento el origen de estas endotoxinas había sido incierto. El papel del LPS es controvertido, pues es un inmunomodulador pro Th1, capaz, en cierta forma de prevenir la respuesta alérgica IgE en edades tempranas. Sin embargo, la interacción del LPS con las mucosas respiratorias pulmonares promueve la inflamación y el desarrollo del asma. Particularmente, ha sido bien identificada la interacción entre el alergeno mayor Der p 2 o Der f 2 y el LPS, amplificando la respuesta inflamatoria local, mediante mecanismos de la inmunidad innata, activando el receptor TLR4 y la vía Th17. Dilucidar el papel del LPS en los extractos alergénicos pudiera ser importante para lograr una mejor comprensión de los mecanismos de acción de la inmunoterapia alergeno específica. Resulta también intrigante que en contraste con la amplia alergenicidad de las proteínas propias del ácaro, ninguna de las proteínas bacterianas mostró actividad de unión de IgE.

En conclusión, este estudio significa un avance importante en la caracterización de los alergenos de ácaros, con la aplicación de las modernas herramientas biotecnológicas, y posiblemente en la comprensión integral de la etiología de la enfermedad alérgica respiratoria. Sus resultados son de evidente utilidad en el desarrollo futuro de medios de diagnósticos y vacunas terapéuticas.

Referencias


[1] Furumizo RT and Wharton GM (1975) A case of postimaginal moult in the American house dust mite Dermatophagoides farinae Hughes 1961 (Acari: Proglyphidae). Acarologia, 17, 730-733.

[2] Valerio CR, Murray P,  Arlian LG, Slater JE. Bacterial 16S ribosomal DNA in house dust mite cultures J Allergy Clin Immunol 2005;116(6):1296-1300

Por DrC Alexis Labrada

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ene 14 2015

Efecto de las infecciones helmínticas sobre la atopia, el asma y la producción de citocinas en niños de un área urbana pobre en América Latina

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Effects of helminth co-infections on atopy, asthma and cytokine production in children living in a poor urban area in Latin America. Alcantara Neves NM, Britto GSG, Veiga RV, Figuereido CA, Fiaccone RL, da Conceicao JS, Cruz AA, Rodrigues LC, Cooper PJ, Pontes de Carvalho LC, Lima Barreto M. BMC Research Notes 2014, 7:817

trichurisspmaleLa relación entre parasitismo intestinal, alergia y asma continúa siendo un aspecto controvertido, particularmente en ambientes tropicales donde tanto unos como otros son comunes. Ambas vertientes de la inmunidad comparten mecanismos como la IgE y los eosinófilos. Este trabajo realizado en zonas pobres de la ciudad de Salvador de Bahia, Brasil, se propuso precisamente estudiar el posible rol de diferentes infecciones helmínticas en la alta prevalencia de alergia y asma observada previamente en esa ciudad costera de clima tropical y húmedo. Con ese fin los autores exploran el efecto de infecciones únicas o múltiples con diferentes parásitos: Ascaris lumbricoides, Trichiura trichiura y Toxocara spp, sobre varias facetas de la respuesta alérgica. De modo general, se detectó una asociación positiva entre el número de infecciones helmínticas y la eosinofilia en sangre periférica, los niveles de IgE total y la producción espontánea de IL-10, así como la producción de citocinas Th2 (IL-5 e IL-13) inducida por antígenos helmínticos. El número de infecciones helmínticas resultó asociado de forma inversa  a la positividad a la prueba cutánea con alergenos respiratorios, aunque sin un efecto estadísticamente significativo sobre el riesgo de asma.

Es conocido que la infección con helmintos induce un potente efecto inmunomodulatorio. Diferentes autores han reportado previamente un decrecimiento de la hipersensibilidad hacia los alergenos en individuos parasitados. Sin embargo, la asociación con el asma, no ha sido consistente. Un trabajo reciente realizado en Cartagena, Colombia, incluso sugiere una posible reactividad cruzada entre Ascaris y el ácaro alergénico Blomia tropicalis como un factor que contribuiría a la alta sensibilización alérgica a ese ácaro en esa región, la cual se asocia significativamente con asma. Sin embargo, otros autores atribuyen a la infección helmíntica un efecto protector antialérgico y antiinflamatorio (en línea con la llamada “teoría de la higiene”), o al menos favoreciendo formas menos severas de asma. Estas discrepancias han sido atribuidas frecuentemente a diferencias entre las poblaciones, al momento en que ocurre la primera infección o a la carga infectiva y su cronicidad, aunque en general, es notoria la falta de conocimientos sistematizados tanto en cuanto a datos epidemiológicos como a los mecanismos inmunológicos eventualmente responsables de dicho efecto.

El presente estudio tiene como peculiaridad que aborda también la Toxocarosis, en adición a las infecciones con  Ascaris y Trichiura. Los helmintos Toxocara canis y Toxocara felis son parásitos de perros y gatos, respectivamente. No obstante, las larvas pueden infectar humanos, particularmente a individuos inmunodeprimidos, aunque no alcanzan a completar su ciclo vital. Pueden atravesar el epitelio intestinal y producir el llamado síndrome larva migrans visceral, que es una infección de naturaleza sistémica que en casos graves puede alcanzar incluso los ojos o el cerebro. Mientras que la prevalencia del parasitismo intestinal con Ascaris y Trichiura tiende a decrecer en los países subdesarrollados en la medida que se aplican normas de sanidad pública, las infecciones con Toxocara no son afectadas en el mismo grado y continúan siendo muy prevalentes. Las medidas efectivas para contrarrestar éstas se basan en el control sanitario sobre las mascotas domésticas (perros y gatos, particularmente los cachorros) lo cual no resulta fácil de generalizar, sobre todo en los países del llamado tercer mundo. Estudios anteriores han informado que los humanos con seropositividad a Toxocara (que es un indicador de infección actual o pasada) sin evidencias de otras infecciones helmínticas, tendrían mayores valores de marcadores alérgicos (como eosinofilia e IgE total)  en edades tempranas  y un riesgo más elevado de sufrir atopia y asma.

El estudio actual se realizó en 1445  niños entre 4 y 11 años. De ellos, 15.8% estaba infectado con Ascaris lumbricoides, 13.8% con T. trichiura, mientras que 47.8%  resultó con seropositividad IgG a Toxocara spp. Las pruebas cutáneas se realizaron con extractos alergénicos de los ácaros Dermatophagoides pteronyssinus, Blomia tropicalis, de dos especies de cucarachas (Blatella germanica y Periplaneta americana), hongos, epitelios de gato y perro. Sin embargo, la positividad a los últimos tres resultó muy baja (<4%) y por lo tanto no fue tenida en cuenta para los análisis de asociación. 37% de los niños mostraron IgE específica positiva hacia alguno de los alergenos, mientras que la prueba cutánea resultó positiva en el 30%. La prevalencia de asma fue de 22.7%, incluyendo 12% con asma no atópica (o sea, sin positividad en la IgE específica o la prueba cutánea) y 10.7% con asma atópica. El número de infecciones helmínticas concomitantes con los tres parásitos mostró una asociación estadísticamente significativa con la eosinofilia y los niveles de IgE total, en sentido positivo y de una manera dosis-dependiente, es decir a más infecciones, más eosinófilos e IgE total. En contraste, la asociación con la prueba cutánea, indicadora de sensibilización alergeno-específica, fue inversa. Sin embargo, la asociación con la IgE alergeno-específica determinada in-vitro no alcanzó significación estadística aunque mostró también una tendencia hacia la asociación inversa. En cuanto a la producción de citocinas, el número de infecciones helmínticas correlacionó con la inducción de las citocinas Th2: IL-5 e IL13, en cultivos de células de sangre periférica estimuladas con A. lumbricoides, el único antígeno evaluado. En el caso de la producción espontánea (no estimulada por antígenos específicos), solamente la IL-10 se mostró asociada significativamente con las infecciones parasitarias, en un sentido positivo, aunque la IL-5 también mostró una tendencia en el mismo sentido sin alcanzar significación estadística.

Estudios anteriores habían encontrado asociaciones positivas entre el riesgo de asma y la infección intestinal con A. lumbricoides y negativas entre las pruebas cutáneas a alergenos y la infección con T. trichiura y otros nemátodos intestinales (Necator americanus y Ancylostoma duodenale). En ese sentido los datos actuales no son contradictorios. Los datos relativos a las infecciones sistémicas revisten mayor novedad. En ese caso, los datos publicados anteriormente indicaban una asociación positiva con asma y atopia en algunos estudios. Un estudio anterior de estos mismos autores en población infantil mostró que la infección helmíntica intestinal y con Toxocara estaban correlacionados inversamente con las pruebas cutáneas, mientras que la infección con T. trichiura y la presencia de IgE anti Ascaris correlacionaban positivamente con asma en la niñez temprana, aunque la infección severa con  este parásito se asociaba con protección contra la reactividad cutánea a medida que avanzaba la edad.

Los autores especulan sobre el posible mecanismo que explique la inhibición de la reactividad cutánea a los alérgenos, que n fue posible atribuir a posible efecto bloqueador de altos niveles de IgE policlonal. En su lugar una posible explicación sería el efecto inhibitorio de la IL-10 sobre la función de los mastocitos. A su vez la estimulación espontánea de IL-10 se basaría en la proliferación de células Treg con reactividad cruzada entre alérgenos y antígenos helmínticos, aunque el artículo no provee ninguna prueba en ese sentido.

Una mayor complejidad reviste la asociación con el asma que los autores atribuyen a la presencia de diferentes fenotipos, en particular el fenotipo “no  atópico” fue sorprendentemente alto para una población infantil en este estudio. Aunque el trabajo no pudo revelar una asociación significativa de la infección parasitaria con el asma, la tendencia en cuanto a asma no atópica fue claramente hacia una asociación positiva con el número de infecciones. O sea, a pesar del efecto protector antialérgico, el mismo no se revierte en una protección contra el asma de naturaleza alérgica, e incluso, tiende a contribuir al asma no alérgica, lo cual en cierta medida, no concuerda con otros autores que han encontrado cierto papel protector del parasitismo contra el asma alérgica.

En conclusión, el estudio refuerza la concepción de la existencia de una fuerte asociación entre infecciones parasitarias y el desarrollo de una respuesta Th2 (eosinofilia, IgE total), aunque con un papel protector en cuanto a la inhibición de la respuesta cutánea hacia los alérgenos, que estaría asociado a la inducción espontánea de IL-10, diseccionando de ese modo diferentes componentes de la respuesta Th2/alérgica e incorporando el componente regulatorio, aunque aún sin un esclarecimiento cabal de todos los mecanismos involucrados.

Por Alexis Labrada, DrC.

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